Desidero portare un piccolo contributo al recente dibattito e scambio di informazioni che si è sviluppato sul sito Autismo-Biologia, chiarendo che comunque sto esprimendo un parere personale. Innanzitutto, la possibilità di sviluppare iPSC (ossia cellule pluripotenti a partire da cellule differenziate) utilizzando la polpa dentaria dei dentini da latte è sicuramente un bel risultato perché non sottopone i bambini ad alcun trauma. Buona anche l'idea di costituire una "banca biologica" di cellule della polpa dentaria, ma non mi sembra che possa servire per un utilizzo a breve termine, come chiarisco di seguito. Infatti, non me la sento al momento attuale di porre eccessive speranze nell'approccio che vede la derivazione di cellule nervose da tali cellule pluripotenti per affrontare uno studio di terapia "personalizzata", o almeno non lo ritengo un approccio universalmente valido. Innanzitutto, ogni anomalia genetica, comprese le traslocazioni osservate nel bambino brasiliano, è riscontrabile per definizione in ogni cellula del paziente e quindi non richiede la laboriosa procedura di derivazione delle iPSC e poi, a partire da queste, di cellule neuronali. Anzi, la corretta procedura di derivazione impone la verifica che le cellule derivate dal paziente abbiano alla fine delle procedure lo stesso assetto genetico di partenza, in quanto le procedure stesse potrebbero indurre delle alterazioni genetiche (artefatti). Quindi si impone un preciso match tra le cellule originarie (ad es. quelle della polpa dentaria) e quelle derivate (es. cellule neuronali) e richiede quindi di partire da una corretta individuazione delle eventuali mutazioni. In secondo luogo, le anomalie genetiche potrebbero non avere gli stessi effetti su tutte le cellule e in particolare su tutti i sottotipi di cellule neuronali, per cui sarebbe utile se mai sapere in anticipo quali sono le cellule neuronali di interesse e cercare di indirizzare il differenziamento delle iPSC verso tali cellule, cosa al momento di difficile attuazione, anche perché in genere il prodotto del differenziamento delle iPSC non origina una popolazione omogenea. Questo punto è fondamentale perché toglie molto valore all'eventuale individuazione di una "terapia personalizzata". Infatti si imporrebbe a) il confronto tra fenotipi cellulari normali e il fenotipo cellulare del paziente (e qui mi riferisco ad esempio alla morfologia ma soprattutto all'esoma, ossia all'insieme degli RNA prodotti); b) il riscontro di differenze CERTE tra il fenotipo normale e quello del paziente (e questo, attenzione, in presenza di popolazioni cellulari non omogenee sia nei normali sia nel paziente); c) l'individuazione di farmaci o di altri interventi terpeutici in grado di ripristinare un fenotipo normale dopo trattamento "personalizzato" in vitro. Non discuto poi le difficoltà di passare dallo studio in vitro allo studio in vivo (es. la difficoltà da parte di molte molecole di attraversare la barriera emato-encefalica). In terzo luogo, se alla base delle anomalie dell'autismo ci fossero delle alterazioni epigenetiche, che non escludono una base genetica, queste sarebbero molto difficili da individuare con l'approccio delle iPSC, in quanto niente garantisce la rispondenza tra l'acquisizione delle modificazioni epigenetiche che si hanno nel corso dello sviluppo e quelle che si hanno in vitro. Il quarto punto che mi rende perplessa è la nota eterogeneità genetica dell'autismo, che svuota l'utilizzo universale di questo approccio (ma che non toglierebbe niente all'approccio personalizzato). Una eterogeneità genetica cui fa riscontro un'impressionante comunanza di sintomi clinici, tali da definire la sindrome dello spettro autistico a dispetto delle differenze genetiche (e, apparentemente, ambientali). E, come si sta vedendo ormai in diversi laboratori, la presenza di alcune caratteristiche fenotipiche di carattere biochimico che sembrano accomunare pazienti sicuramente portatori di microeterogeneità genetiche. In definitiva, ben venga ogni ricerca scientifica seria sull'autismo, ma non è detto che, al momento attuale, questo delle iPSC sia l'approccio più fruttuoso. A tutti l'augurio che il 2015 possa essere comunque un "anno di svolta", che porti a significativi avanzamenti nella ricerca sull'autismo e dia un po' di speranza alle famiglie. Marina Marini (Professore Associato di Biologia Appliocata, DIMES, Scuola di Medicina, Università di Bologna) Il 31/12/2014 20:20, daniela marianicerati ha scritto:

Mi è stato inviato da un iscritto alla lista un messaggio preso dalla rete di cui copio uno stralcio CELLULE STAMINALI per una TERAPIA PERSONALIZZATA A.Alysson Muotri,professore di pediatria all’Universita’ della California, ed i suoi collaboratori hanno sviluppato un metodo per usare le cellule staminali raccolte dalla polpa dei denti per creare cellule staminali pluripotenti (iPS) _Muotri vorrebbe fondare una banca per questo tipo di cellule, derivandole da bambini con autismo; facendo poi differenziare queste cellule in neuroni spera di comprendere i cambiamenti a livello cellulare e molecolare soggiacenti all’autismo. B. B. Di solito le cellule iPS sono derivate da prelievi di pelle, ma la strategia di derivarle da denti di latte evita una biopsia della pelle che puo’ essere traumatica per bambini con autismo; Fin qui il messaggio è corretto. Poi però prosegue C.e’ interessante la possibilita’ che i neuroni derivati da una persona con autismo possano essere usati per selezionare le terapie piu’ utili per quella persona. Sembra che già ora sia possibile per ogni persona con autismo avere una terapia personalizzata con la procedura della riprogrammazione delle cellule. In seguito viene dato il resoconto di uno studio pubblicato nel novembre scorso su Molecular Psychiatry http://www.nature.com/mp/journal/vaop/ncurrent/full/mp2014141a.html

La riprogrammazione delle cellule (dalla polpa dentaria a cellule staminali pluripotenti e poi a neuroni) e’ stata applicata ad un bambinobrasiliano ed i ricercatori hanno scoperto che questo bambino ha una traslocazione nel DNA che riguarda due geni: VPRVP , che e’ coinvolto nel ciclo cellulare ma non e’ espresso nel sistema nervoso, e TRPC6, un canale del calcio espresso in parti delle sinapsi, le connessioni fra i neuroni, durante lo sviluppo-Gli studi di espressione genica hanno rivelato che le cellule iPS derivate dal bambino producevano soltanto la meta’ del quantitativo di proteina normalmente espressa dal gene TRPC6

Si tratta quindi di un caso di autismo in cui è stata individuata una/de novo balanced translocation disruption of TRPC6, a cation channel, in a non-syndromic autistic individual/.

Per scoprire questa mutazione /“Genetic sequencing of TRPC6 in 1041 ASD individuals and 2872 controls revealed significantly more nonsynonymous mutations in the ASD population, and identified loss-of-function mutations with incomplete penetrance in two patients//”./ Anche in questo lavoro quindi si è studiata una condizione monogenica rara. Lo studio delle malattie monogeniche è una delle strade che sta compiendo la ricerca per capire anzitutto le malattie monogeniche stesse risalendo dal gene alla via di cui quel gene fa parte, con la speranza di arrivare alla scoperta di vie comuni alla grande massa dei casi criptogenetici. Una volta scoperte le vie patogenetiche la finalità è quella di cercare dei target su cui agire con i farmaci.

Mi riprometto di tornare sull’articolo che, anche se meno trionfale del resoconto che ne dà la rete, mi pare comunque molto interessante All’anno prossimo Daniela

_______________________________________________ Lista di discussione autismo-biologia [email protected] ANGSA (Associazione Nazionale Genitori Soggetti Autistici). Fondazione Augusta Pini ed Istituto del Buon Pastore Onlus. Per cancellarsi dalla lista inviare un messaggio a: [email protected]

l Mercoledì 31 Dicembre 2014 20:22, daniela marianicerati <[email protected]> ha scritto: Mi è stato inviato da un iscritto alla lista un messaggio presodalla rete da cui copio  qualche stralcio CELLULE STAMINALI per una TERAPIA PERSONALIZZATAA.   Alysson Muotri,professore di pediatria all’Universita’ dellaCalifornia, ed i suoi collaboratori hanno sviluppato un metodo per usare lecellule staminali raccolte dalla polpa dei denti per creare cellule staminalipluripotenti (iPS) _Muotri vorrebbe fondare una banca per questo tipo dicellule, derivandole da bambini con autismo; facendo poi differenziare questecellule in neuroni spera di comprendere i cambiamenti a livello cellulare emolecolare soggiacenti all’autismo.  Fin qui il messaggio è corretto. Poi però prosegueC.     e’ interessante la possibilita’ che i neuroni derivati da unapersona con autismo possano essere usati per selezionare le terapie piu’ utiliper quella persona. Sembra che già ora sia possibile per ognipersona con autismo avere una terapia personalizzata con la procedura dellariprogrammazione delle cellule. In realtà questa procedura è utilizzata al momento attuale per studiare la patogenesi ed eventuali terapie conseguenti nelle malattie monogeniche. Lo studio delle malattie monogeniche è una delle strade che sta compiendola ricerca per capire le malattie monogeniche stesse risalendo dalgene alla via di cui quel gene fa parte, con la speranza di arrivare allascoperta di  vie comuni alla grande massadei casi criptogenetici.  19 gennaio Un iscritto alla lista che lavora in questo campo mi ha riferito che per alcune malattie monogeniche si stanno già facendo dei piccoli trials su pazienti, ma tali trials non sono ancora pubblicati e l'esito ancora non si conosce.  I lavori pubblicati parlano di ricerca e possibili terapie in vitro e non ancora in vivo.Per avere un'idea dello stato attuale della ricerca è interessante, tra gli altri, il seguente l'articolo"SHANK3 and IGF1 restore synaptic deficits in neurons from 22q13 deletion syndrome patients, Aleksandr Shcheglovitov e coll, Nature 2013, 14 nov, 503,  267 - 271. L'articolo è di non facile lettura, per cui ho chiesto aiuto a Giorgio Lenaz che, disponibile come sempre, ci  ha mandato  quanto segue SHANK3 e IGF1 ripristinano i deficit sinaptici inneuroni da pazienti con la sindrome da delezione del cromosoma  22q13 Shcheglovitov A et al Stanford University,California     Sitratta di un lavoro sostanzialmente di base, che aumenta le conoscenze sui meccanismidella maturazione delle sinapsi e quindi indirettamente può dare indicazionirelative ai disordini correlati all’autismo. L’interesse di questo lavoro è lacreazione di neuroni e formazione delle relative sinapsi da cellule staminalipluripotenti umane. Il modellostudiato è una sindrome in cui si hanno, insieme a un difetto dello sviluppocerebrale, anche sintomatologie correlate all’autismo. La possibilità dicorreggere in vitro gli effetti della malattia con un fattore di crescita,quindi una molecola ormono-simile, potrebbe aprire prospettive terapeutiche.   Lasindrome di Phelan- McDermid (PMDS) è un disordine dello sviluppo neuronalecaratterizzato da rallentamento globale dello sviluppo, incapacità di parlare,disabilità intellettuale e forte rischio di sviluppare disordini dello spettroautistico (ASD). La sindrome è causata da delezioni eterozigoti nel cromosoma22q13.3. Tra i geni di questa regione si trova SHANK3 che codifica per unaproteina  situata nella zonapostsinaptica.  Rare mutazioni di SHANK3sono state associate a ASD idiopatici e schizofrenia. Sebbene SHANK3 sia ilgene candidato più probabile per la PMDS, non sono note le alterazioni molecolari e cellulariassociate a questa sindrome. Inquesto studio gli autori hanno generato 6 linee di cellule staminalipluripotenti indotte (iPS) da fibroblasti cutanei di due pazienti  PMDS con autismo;  queste cellule presentavano estese delezioninel cromosoma 22,  in confronto acontrolli di linee cellulari iPS e cellule staminali embrionali precedentementecaratterizzate. Tutte queste linee sono state indotte a differenziarsi inneuroni maturi. L’analisi dell’espressione genica di queste linee ha dimostratoche solo il 2-5% delle cellule erano neuroni maturi dal punto di vista deicollegamenti sinaptici, tuttavia potevano venir arricchite di marcatorisinaptici con opportune tecniche di biologia molecolare presentando così altilivelli di SHANK1-3. Gliautori hanno poi investigato le caratteristiche elettrofisiologiche di questineuroni; i neuroni derivati dai pazienti PMDS presentavano alcune anomalieelettriche che rivelavano una diminuita attività sinaptica. Questa diminuitaattività non era dovuta alla lieve diminuzione osservata del numero di neuroni,ma era una caratteristica intrinseca delle cellule e coinvolgeva sia irecettori AMPA che quelli NMDA. [Nellesinapsi eccitatorie a glutammato ci sono due tipi principali direcettori-canali che trasportano ioni promuovendo l’attività post-sinaptica; irecettori detti AMPA dal nome di un agonista lasciano passare gli ioni Na+ eK+  e sono responsabili di unatrasmissione sinaptica “normale”, mentre i recettori NMDA, dal nomedell’agonista N-metil-D-aspartato, lasciano passare anche il Ca2+ e sono responsabilidel cosiddetto potenziamento a lungo termine che esalta la trasmissionesinaptica eccitatoria e si ritiene alla base della memoria edell’apprendimento]. Al contrario non esisteva alcuna alterazione dellesinapsi inibitorie che usano GABA come neurotrasmettitore.  Pertanto si può presumere che il difettosinaptico in PMDS sia dovuto a uno sbilancio fra eccitazione e inibizionesinaptica. L’analisisuccessiva ha dimostrato che il difetto di eccitazione sinaptica eraeffettivamente dovuto a un diminuito numero di recettori AMPA e NMDA, mentre ilnumero di recettori GABA era normale. Inoltre studi di immuno-colorazionedimostravano che, oltre al diminuito numero di recettori,  c’era pure un numero minore di contattisinaptici eccitatori. Ildifetto nella sindrome PMDS  si ritiene ingenere dovuto a mancanza di  una copia diSHANK3, tuttavia  nei pazienti  mancano numerosi altri geni (da 10 a 100); un’analisidell’espressione di  SHANK3 e altri geniper proteine implicate nello sviluppo delle sinapsi rivelava tuttavia che neineuroni studiati  solo l’espressione diSHANK3 era diminuita (sia l’RNA messaggero che la relativa proteina). Unaprova decisiva che è la diminuita espressione di SHANK3 a provocare lealterazioni sinaptiche osservate è stata fornita aumentando l’espressione diSHANK3  artificialmente nei neuroni PMDS.  Dopo l’introduzione del gene SHANK3 contecniche di manipolazione molecolare l’attività elettrica eccitatoria di tuttii recettori AMPA e di gran parte dei recettori NMDA veniva normalizzata.  Ciò suggerisce tra l’altro che il ruolo diSHANK3 può essere differente sui due tipi di recettori. Gliautori hanno poi tentato di ripristinare l’attività sinaptica con mezzifarmacologici; fra i molti tentativi solo la somministrazione di IGF1 [insulin-like growth factor 1 o somatomedinaC, fattore di crescita con proprietà anaboliche] ai neuroni PMDS è stata ingrado di aumentare i contatti sinaptici tramite l’aumentata sintesi delleproteine sinaptiche implicate nei contatti stessi e di ripristinare l’attivitàelettrica evocata da AMPA e NMDA. Ulterioriesperimenti compiuti dagli autori hanno però mostrato che il meccanismo d’azione di IGF1 nei confrontidell’attività sinaptica in relazione a SHANK3 è estremamente complesso.Paradossalmente IGF1 fa diminuire i livelli di SHANK3 ma determina un aumentodi PSD95 [Si tratta di una proteina dellazona densa postsinaptica, capace di inviare segnali dei neurotrasmettitoriglutammato e dopamina al DNA nucleare] . I risultati sono di difficileinterpretazione, ma sembrerebbero dimostrare che sia SHANK3 che PSD95 sonorichiesti per la formazione delle sinapsi, ma in tempi diversi: SHANK3 èrichiesta in una fase precoce della formazione delle sinapsi, mentre IGF1promuove la successiva maturazione delle stesse sinapsi determinando la perditadi SHANK3 e il reclutamento di PSD95.