[autismo-biologia] nuove ipotesi patogenetiche con prospettive terapeutiche promettenti

[daniela marianicerati]

 Hotrovato di estremo interesse l'articolo “Serafrom Children with Autism Induce Autistic Features Which Can BeRescued with a CNTF Small Peptide Mimetic in Rats”http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4359103/Illavoro apre nuove prospettive nell'interpretazione della patogenesidell'autismo chiamando in causa una disregolazione dei fattorineurotrofici. Pone inoltre le premesse per terapie innovative, dalmomento che un peptide di 11 aminoacidi (denominato Peptide 6) éstato in grado di prevenire gli effetti patogeni dei sieri di bambinicon autismo sul neurosviluppo dei ratti. Anche l' amico Giorgio Lenazha condiviso il mio giudizio positivo e ha ritenuto opportuno dare del complesso articolo un ampio resoconto nel quale ha riportato tutti i risultati conseguiti. Alui vanno i miei ringraziamenti a nome degli iscritti alla lista. Edecco il suo resoconto 

Ilsiero di bambini autistici induce caratteristiche di autismo chepossono essere contrastate da un piccolo peptide simile a CNTF(ciliary neurotrophic factor).KazimSF,Cardenas-AguayoMdel C,ArifM,BlanchardJ,FayyazF,Grundke-IqbalI,IqbalK.IngeGrundke-Iqbal Research Floor, Department of Neurochemistry, New YorkState Institute for Basic Research in Developmental Disabilities(NYSIBR), Staten Island, New York, United States of AmericaPLOSOne 13 marzo 2016
INTRODUZIONEL’incidenzadei disordini dello spettro autistico (ASD) è recentemente aumentatain modo drammatico; il Center for Disease Control and Preventionnegli USA comunica che ASD colpiscono negli USA 1 su 88 nati, conprevalenza di 5 volte sui maschi. Anche se l’eziopatogenesi non èchiarita, la letteratura scientifica sembra indicareun’eziopatogenesi multifattoriale comprendente fattori genetici,ambientali e immunologici, abbinata a disregolazione neurotrofica eaumentata sensibilità agli stress ossidativi. Unfenomeno consistentemente osservato nell’autismo è una acceleratacrescita del cervello nelle prime fasi dello sviluppo, seguita poi dacrescita diminuita associata a minor numero e dimensione dei neuronie delle ramificazioni dendritiche in alcune aree cerebrali comel’ippocampo, il cervelletto e l’amigdala. Questi risultatisuggeriscono un alterato controllo dei meccanismi dello sviluppo edel differenziamento del sistema nervoso centrale, con sbilanciodella formazione e rimozione dei neuroni e delle sinapsi. Unodei fattori preminenti nel bilanciamento della normale neurogenesi èrappresentato dal microambiente fornito da vari fattori neurotrofici.La disregolazione dei fattori neurotrofici può senz’altro esserela causa delle anormalità osservate nell’autismo nellaneurogenesi, nella migrazione e nel differenziamento neuronale, nellamaturazione e connessione delle sinapsi, nonché nella rimozione dineuroni e sinapsi, che portano a deficit del comportamento sociale edei processi cognitivi. Visono molteplici osservazioni in letteratura di alterazioni deilivelli di fattori neurotrofici nel cervello, nel liquor e nel sierodi soggetti autistici. Tali alterazioni potrebbero dipendere in granparte dallo stress ossidativo nel periodo prenatale e durante leprime fasi dello sviluppo, considerato da vari autori come fattoreprimario nella patogenesi dell’autismo. Per esempio è statoosservato che uno stress ossidativo blocca nei neuroni l’attivitàdel Fattore Neurotrofico Ciliare (CNTF) che è essenziale per lasopravvivenza ed il mantenimento dei neuroni. Parimenti i livelliserici di Fattore Neurotrofico derivato dal cervello (BDNF),diminuiti nei bambini autistici, sono stati collegati a un aumentatostress ossidativo.Vienepertanto ipotizzato che colpire le anormalità neurotrofichenell’autismo possa rappresentare un utile approccio terapeutico. Ariprova di ciò era stato in precedenza osservato che unapreparazione neurotrofica peptidergica denominata Cerebrolisina èin grado di proteggere i neuroni corticali dalla neuro-degenerazioneindotta da ferro mediante stress ossidativo, di esaltare laneurogenesi nel giro dentato e la memoria ad esso collegata, edinfine di migliorare il comportamento sociale di 17 su 19 bambiniautistici.L’utilizzoterapeutico di questi peptidi, cioè BDNF e CNTF, è limitato dallalunghezza di queste molecole che pertanto iniettate nel sangue nonriescono a raggiungere il cervello e inoltre hanno nel plasma emivitemolto brevi. Inoltre era stato anche osservato che CNTF produce gravieffetti collaterali. Per questo motivo gli Autori di questapubblicazione hanno sintetizzato un peptide di 11 aminoacidi(denominato Peptide 6) che corrisponde alla regione attiva delfattore trofico stesso e che è in grado di superare la barrieraematoencefalica oltre ad avere nel sangue un’emivita ragionevole dicirca 6 ore e a non indurre effetti collaterali. Questo peptide CNTF-mimetico nei ratti esercita effetti benefici su neurogenesi,plasticità sinaptica e proprietà cognitive agendo tramiteinibizione della via di segnale del fattore LIF (Leukemia InhibitoryFactor) e attivazione del BDNF attraverso una aumentata trascrizionedel gene.Inquesto lavoro gli Autori hanno dimostrato i seguenti punti:   
   - I sieri di bambini autistici provocano neuro-degenerazione e aumentato stress ossidativo in colture primarie di neuroni murini embrionali al 18° giorno; 
   - L’iniezione intra-cerebro-ventricolare di sieri autistici nel ratto subito dopo la nascita induce il caratteristico fenotipo autistico; 
   - Nei due modelli precedenti, e cioè sia in vitro sia in vivo, il Peptide 6 esercita un effetto protettivo.
RISULTATISierida bambini autistici inducono morte cellulare e stress ossidativo,corretti da pretrattamento col peptide P6, in colture primarie dineuroni corticali di topo.Erastato osservato in precedenza che il siero di soggetti autisticiimpedisce lo sviluppo e la proliferazione di cellule umaneprogenitrici dei neuroni corticali e di possedere autoanticorpicontro queste cellule. In questo studio sono stati impiegati 22 paiadi sieri (autistici e controlli) in tre diversi gruppi di colturecellulari e si è visto che il siero di bambini autistici incubatoper 72 ore provoca alterazioni morfologiche nei neuroni corticali ditopo in coltura, in particolare diminuzione della densità cellularee della lunghezza dei neuriti, mentre non si osservano alterazioniincubando le cellule con sieri di soggetti normali. Pretrattando lecolture per tre ore col peptide P6 le alterazioni indotte dai sieriautistici non si verificavano. Tutti i dati erano statisticamentesignificativi. I sieri autistici, ma non quelli normali, inoltreinducevano un grado significativo di morte cellulare, prevenuta dalpeptide P6. Infine i sieri autistici inducevano un aumento diproduzione di specie reattive dell’ossigeno e di danni cellulariossidativi come la perossidazione lipidica, sempre contrastati dalpeptide P6.Ilivelli di fattori neurotrofici sono alterati nei sieri di bambiniautistici.Ilivelli di alcuni fattori neurotrofici sono stati misurati con unmetodo immuno-elettroforetico (Western blotting) in tre sieriautistici che avevano provocato le alterazioni sopraddette e trecontrolli; i livelli di CNTF e BDNF erano fortemente diminuiti,mentre i livelli di pro-BDNF, FGF-2 e LIF erano aumentati e quelli diNGF non subivano alterazioni.Isieri di bambini autistici inducono in ratti neonati un ritardo dellosviluppo impedito dal co-trattamento col peptide P6.Glistessi gruppi di 3 sieri autistici e 3 sieri controllo usati perl’esperimento precedente sono stati utilizzati in assenza o inpresenza del peptide P6 mediante iniezione intra-cerebro-ventricolarein ratti entro 12 ore dalla nascita. Sono stati impiegati 5 gruppi dianimali comprendenti ognuno 5-6 individui: (1) ratti controlloiniettati soluzione fisiologica; (2) ratti iniettati con sieriautistici (5-6 per ogni siero); (3) ratti iniettati con siericontrollo (5-6 per ogni siero); (4) ratti iniettati con sieriautistici più P6; (5) ratti iniettati con sieri controllo più P6.E’stata innanzi tutto presa in esame la comparsa del riflesso diraddrizzamento passando da una posizione supina fino ad appoggiare lezampe sulla superficie: questo riflesso esprime il grado di sviluppodei processi di equilibrio e coordinazione motoria. Nei controlliiniettati con soluzione fisiologica e nei ratti trattati con sierinormali il riflesso compare dopo circa 4 giorni di vita, mentre neiratti trattati con sieri autistici la comparsa è significativamentepiù tardiva. Il peptide P6 tende a migliorare la comparsa delriflesso in questi ultimi animali. Simili risultati erano ottenutivalutando la capacità dell’animale di raddrizzarsi durante unacaduta da 12 cm. Un riflesso avente simile scopo è quello dellageotassi negativa, in cui il ratto è messo a testa in giù su unpiano inclinato e si misura la capacità di ruotare di 180° permettersi a testa in su. Anche in questo caso nei ratti iniettati consieri autistici il riflesso compariva in modo significativamente piùtardivo; l’effetto positivo del P6 era visibile ma non in modostatisticamente significativo. Dei numerosi test applicati alcuniperò non hanno dato variazioni significative fra i vari gruppi. Gliautori osservano tuttavia che i test più idonei a misurarecoordinazione e apprendimento di particolari abilità erano positivi,mentre quelli atti a valutare più che altro riflessi inconsci eranonegativi.Pervalutare la capacità di comunicazione sociale nei ratti neonati èstato usato un test che misura come forma di linguaggio gliultrasuoni emessi come richiamo quando i neonati vengono allontanatidalla madre e dagli altri piccoli. Usando questo test è stato vistoche il numero di richiami dei ratti posti in isolamento nei giorni 5,7, e 9 dalla nascita era molto minore nel gruppo iniettato con sieridi bambini autistici che nei controlli non iniettati o iniettati consieri normali. Il trattamento con P6 non produceva tuttavia alcuneffetto significativo.Iltrattamento col peptide P6 migliora il comportamento sociale di rattigiovani trattati con sieri di soggetti autistici.Iltest consiste nel porre giovani ratti (21-23 giorni di vita) in unascatola divisa in 3 camere comunicanti in cui l’animale viene messoin contatto con un suo simile in confronto ad un oggetto inanimato, ein un altro tipo di prova con un altro ratto già noto rispetto aduno completamente sconosciuto In entrambi i tipi di prova i rattiiniettati con sieri autistici manifestavano un comportamento anormalecon interazione sociale diminuita e scarsa propensione per le novitàdi interazione in confronto con i controlli. Questi comportamenti nelratto sono considerati corrispondenti al comportamento socialeautistico nell’uomo. Il trattamento col peptide P6 ristabiliva ingran parte il comportamento normale. Isieri di bambini autistici inducono in cervelli di ratti giovanineurodegenerazione e aumentano lo stress ossidativo e lo statoinfiammatorio, contrastati dal peptide P6 tramite aumentataespressione di BDNF. Parallelamenteagli studi dell’effetto dei sieri di bambini autistici su cellulenervose coltivate in vitro è stato condotto uno studio in vivo pervalutare l’effetto di tali sieri sul cervello di giovani ratti,valutando la neuro-degenerazione e lo stress ossidativo. Con unametodica istochimica si è dimostrato che i sieri autisticiinducevano un marcato grado di neuro-degenerazione in confronto coicontrolli non iniettati o iniettati con sieri normali. L’effettodegenerativo veniva impedito dalla somministrazione del peptide P6.Similmente i sieri autistici inducevano un danno ossidativo al DNA,evidenziato dall’aumentata presenza di neuroni positivi allamarcatura di 8-idrossi-deossiguanosina, un prodotto della ossidazionedel DNA; anche in questo caso P6 impediva l’insorgere del danno.Unbio-marcatore di neuro-infiammazione era pure sensibilmente aumentatonei cervelli dei ratti in seguito alla iniezione di sieri autisticima non di sieri controllo. Anche in questo caso laneuro-infiammazione era inibita dal peptide P6.Gliautori hanno poi esaminato l’effetto dei sieri autisticisull’espressione dei fattori di crescita BDNF e CNTF nellacorteccia cerebrale di ratti giovani, valutando sia i livelli dellerispettive proteine che quelli dei corrispondenti RNA messaggeri(mRNA). Per quanto riguarda BDNF i sieri autistici determinavano unamarcata diminuzione dei livelli proteici e di mRNA, indicando unadiminuita trascrizione del gene come causa dei diminuiti livelliproteici. Ancora una volta il peptide P6 ristabiliva i livellinormali. Per quanto riguarda invece CNTF non si sono osservatevariazioni importanti. Presumibilmente il peptide P6 agisce tramitestimolazione dell’espressione genica di BDNF.DISCUSSIONETrale varie ipotesi formulate per l’eziologia dei disordini dellospettro autistico, una delle più importanti suggerisce uno sbilancioprecoce dei fattori neurotrofici tale da fornire un inappropriatomilieu per lo sviluppo del sistema nervoso. Questo studio dimostrache alterazioni nei livelli di alcuni fattori neurotrofici nel sierodi individui autistici possono indurre caratteristicheneuro-comportamentali di tipo autistico nei ratti. Lasomministrazione del peptide P6 che mima la parte attiva di unfattore proteico neurotrofico, il CNTF, è in grado di impedire ideficit di tipo autistico probabilmente tramite elevazione deilivelli di un altro fattore neurotrofico, il BDNF. Questirisultati provvedono un razionale per uno screening diagnostico suisieri autistici nonché di una possibile terapia basata suregolazione dello sbilancio neurotrofico. Inoltre questo studiopermette di creare un modello animale dell’autismo tramiteiniezione di siero di soggetti autistici.Trai fattori neurotrofici, il BDNF sembra avere un ruolo essenzialenello sviluppo del sistema nervoso centrale, in particolare laformazione di nuovi neuroni, di sinapsi, e nella plasticitàsinaptica, cioè la capacità delle sinapsi di svilupparsi sulla basedegli stimoli ricevuti, tutte capacità che sono diminuite inbambini, adolescenti ed adulti con autismo. Lo sbilancio in fattorineurotrofici insieme all’aumentato stress ossidativo possonocontribuire in modo determinante alla patogenesi dell’autismo. Lostress ossidativo, portando ad alterazioni strutturali delleproteine, dei lipidi e del DNA dei neuroni, può ben contribuire allealterazioni funzionali proprie dell’autismo stesso. Non è chiarocome l’aumentata produzione di specie reattive dell’ossigeno siacollegata allo sbilancio neurotrofico, ma è comunque evidente che isieri di soggetti autistici, che hanno alterati livelli di fattorineurotrofici, inducono stress ossidativo e uno statoneuro-infiammatorio; pertanto il disturbato ambiente neuroumorale puòcreare a sua volta un ambiente ossidante e pro-infiammatorio, cheporta a danni strutturali e funzionali ai neuroni. L’ipotesi èsuffragata dal fatto che la sola aggiunta del peptide P6,ristabilendo i livelli di BDNF, risolve tutte le altre anomalieriscontrate.                   GiorgioLenaz, Professore emerito di Chimica Biologica dell'Universitá diBologna
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